今天Emma女士來(lái)和大家一起聊一聊轉染，什么是轉染呢？

PART 01 認識轉染

轉染——是指將外源基因如DNA、RNA等導入真核細胞的技術(shù)。隨著(zhù)分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉染已經(jīng)成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)實(shí)驗中，其應用越來(lái)越廣泛。

PART 02 常見(jiàn)的細胞轉染技術(shù)

細胞轉染技術(shù)主要分為三大類(lèi)：物理介導法、化學(xué)介導法及生物介導法：

物理介導法

一般是電穿孔法，適用于極難轉染的細胞，如原代細胞，轉染效率高，但轉染后細胞死亡率也很高。

化學(xué)介導法

選用轉染試劑與核酸結合，通過(guò)內吞作用進(jìn)入細胞。一般轉染試劑有以下三種：

• 磷酸鈣：成本低，但轉染效率低，重復性差；

• 陽(yáng)離子脂質(zhì)體：轉染效率較高，但脂質(zhì)體可能改變細胞的結構，對細胞毒性較大；

• 非脂質(zhì)體試劑：以脂類(lèi)為主的多組分試劑，轉染效率高，對細胞毒性低，且可生物降解。

• 
  

生物介導法

病毒載體，轉染效率高，但整合到基因組的風(fēng)險大，基因長(cháng)度也受限，比較適合構建穩轉的細胞株。

所以，綜合考慮到高轉染效率和低細胞毒性的結合，請看下圖：

X-tremeGENE™360轉染試劑在轉染效率和低細胞毒性方面都勝出了ThermoFisher的Lipofectamine。

相信X-tremeGENE™系列也是大家熟悉的經(jīng)典轉染試劑，今天Emma女士再來(lái)給大家好好聊聊它。

X-tremeGENE™是Roche公司的注冊商標，我司東銳科技今年三月份也榮升為Roche的一級代理商。

X-tremeGENE™系列是非脂質(zhì)體轉染試劑，此系列轉染試劑可以在含血清培養液中進(jìn)行轉染實(shí)驗，不論是用DNA還是RNA轉染，也不論是轉染普通細胞系或者難轉染的細胞系，都可以很輕松的找到適合的那一款。

請看更詳細的細胞類(lèi)型對應表：

用GFP編碼的pcDNA3.1質(zhì)?；蛘邿晒馑孛妇幋a的pCI質(zhì)粒轉染細胞的實(shí)驗，驗證了以下細胞類(lèi)型對應的轉染試劑：

?：可以使用；??：推薦使用；???：最佳推薦使用

話(huà)不多說(shuō)，上Protocol干貨！

轉染Protocol以轉染12孔板中單孔細胞的量為例

01 平衡試劑

X-tremeGENE轉染試劑、DNA和稀釋液平衡至15~25°C，輕輕Vortex轉染試劑；

02 稀釋DNA

用稀釋液稀釋DNA，稀釋液可以選擇無(wú)血清或者減血清培養基，稀釋后的濃度為1ug質(zhì)粒DNA/100ul稀釋液（0.01ug/ul），輕輕混勻；

03 分裝稀釋后的DNA

分別吸取4管100ul（含1ugDNA）稀釋液至四支無(wú)菌管中，管上分別標記1:1、2:1、 3:1、和4:1。建議使用無(wú)菌離心管或者組織培養處理過(guò)的圓底96孔培養板；

重要貼士：zui低稀釋液的量是100ul，如果低于100ul會(huì )顯著(zhù)降低轉染效率；

04  混勻轉染試劑和DNA

分別吸取1、2、3、4ul轉染試劑至剛加入100ul稀釋液（含1ugDNA）的四支無(wú)菌管中，對應的標記為1:1,2:1, 3:1, and 4:1，注意轉染試劑不要碰觸到塑料管壁，再輕輕混勻；

重要貼士：避免影響轉染效率，未經(jīng)稀釋的轉染試劑請不要碰觸到塑料管壁，并不要使用硅化處理的吸頭或者吸管。

05 形成轉染試劑/DNA復合物

將轉染試劑和DNA混合物在15~25°C環(huán)境中孵育15分鐘，形成轉染試劑/DNA復合物。

重要貼士：對于某些特殊的細胞系或者低比例的情況可能需要更長(cháng)的孵育時(shí)間，如達到30分鐘。

06 轉染細胞

從培養箱中取出培養容器，培養基可以不進(jìn)行更換。以一滴滴加入的方式向細胞中加入轉染試劑/DNA的復合物。

重要貼士：對于不同的培養容器，加入復合物的量不同，以12孔板單孔的量為例，每孔中（含1ml細胞培養基）加入100ul轉染試劑/DNA復合物（含1ugDNA）；

加入復合物后輕輕混勻培養皿或者培養瓶以保證復合物的均勻分布，如果條件允許，可以使用搖床低速混勻30秒。

一旦在細胞中加入了復合物，就無(wú)需再像其它轉染試劑一樣需要更換新鮮的培養基。

07 檢測目的蛋白含量

轉染細胞后將細胞繼續孵育18-72小時(shí)。孵育的時(shí)間受許多因素的影響，如DNA載體、細胞類(lèi)型、細胞密度、細胞培養基和表達蛋白的類(lèi)型。

孵育之后便可以選擇合適的方式進(jìn)行蛋白的檢測，如熒光定量或者免疫印跡等。

雖然我們有無(wú)比可靠的轉染試劑，但是有時(shí)候為什么還是會(huì )出現實(shí)驗結果不佳的情況呢？

別灰心，這時(shí)候我們需要放大雙眼，來(lái)看一下Emma女士列出的要點(diǎn)，逐一排除原因，很快就可以做出理想的實(shí)驗結果，絕對會(huì )給您未來(lái)發(fā)表的文章增色哦！

PART 03  轉染試劑的技術(shù)答疑

Q：為什么轉染效率不高？

未優(yōu)化最佳的轉染試劑與質(zhì)粒的比例

影響細胞轉染效率的因素較多，主要包括細胞生長(cháng)狀況、傳代次數、轉染試劑與質(zhì)粒的比例和孵育時(shí)間、質(zhì)粒大小等，其中轉染試劑與質(zhì)粒的比例尤為關(guān)鍵。

對于不同的細胞類(lèi)型，轉染試劑與質(zhì)粒的最佳比例也不同。由于不同細胞表面結構、細胞膜、核膜等結構存在較大差異，同種轉染試劑在不同細胞的轉染效率也不盡相同。

因此，對于較難轉染的細胞如原代細胞、神經(jīng)細胞，為提高轉染效率，必須對轉染試劑與質(zhì)粒的比例做進(jìn)一步優(yōu)化。

對于X-tremeGENE™系列的轉染試劑，我們建議轉染試劑與質(zhì)粒的比例按照1:1、2:1、3:1、4:1（ul：ugDNA）四個(gè)比例進(jìn)行測試，選出適合的比例，對于大多數細胞類(lèi)型，3:1的比例是最合適的。

 細胞的數量不夠

對于大多數細胞類(lèi)型來(lái)說(shuō)，建議在細胞密度70%-90%之間進(jìn)行轉染，過(guò)多或者過(guò)少都可能降低轉染效率。

 未調整到最佳的孵育時(shí)間

轉染后最佳的孵育時(shí)間為18-72小時(shí)，對于大多數的細胞類(lèi)型和質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，最佳的孵育時(shí)間是24-48小時(shí)。

 轉染效率受培養基某些組分的抑制

培養基中一些組分如聚陰離子會(huì )影響轉染，保證培養基中無(wú)這樣的組分。

 轉染試劑/DNA復合物的量過(guò)少

稀釋后DNA的量zui低為100ul，過(guò)低的量會(huì )顯著(zhù)降低轉染效率。

Q：為什么轉染后細胞死亡率太高？

細胞密度不適合

對于大多數細胞類(lèi)型來(lái)說(shuō)，建議在細胞密度70%-90%之間進(jìn)行轉染，過(guò)多或者過(guò)少都可能降低轉染效率。

 細胞在無(wú)血清培養基中進(jìn)行培養

對于常規細胞來(lái)說(shuō)，無(wú)血清培養基的營(yíng)養成分不夠，會(huì )降低細胞的存活率，雖然roche的轉染試劑可以在無(wú)血清培養基中進(jìn)行轉染，但考慮到細胞需要血清營(yíng)養成分的供給，應使用正常培養基或者減血清培養基。

 轉染劑/DNA復合物未和細胞混合均勻

應該將復合物以一滴滴緩慢加入的方式加入細胞培養基中，然后輕輕地前后和左右晃動(dòng)，使復合物均勻分布。

 使用了內毒素污染的質(zhì)粒載體

質(zhì)粒應該保證是高純度無(wú)污染的，可以在提完質(zhì)粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，這樣可以起到除菌的效果。

 質(zhì)?；虍a(chǎn)物對細胞有毒害作用

高表達的質(zhì)?；虍a(chǎn)物可能會(huì )使得細胞本身生長(cháng)緩慢或者存活率下降。

 使用了過(guò)多的轉染試劑/DNA復合物

陽(yáng)離子轉染試劑濃度過(guò)高時(shí)，由于帶有很強的正電荷，對細胞有一定的毒性，導致細胞形態(tài)發(fā)生變化，細胞大量死亡，所以應降低復合物的濃度或者增加細胞的濃度。

PART 04   研究方向對應篇

快到文末了，如果您還沒(méi)選擇好您的轉染試劑，也可以按照下面的表格來(lái)選擇。

（點(diǎn)擊圖片查看清晰原圖）

如果有更多的問(wèn)題，歡迎聯(lián)系我們。

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