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化學(xué)發(fā)光 | IVD行業(yè)技術(shù)擔當（下）

更新時(shí)間：2022-04-13 瀏覽次數：2747

上一期，我們大致介紹了化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理和優(yōu)缺點(diǎn)，下面我們就來(lái)詳細說(shuō)說(shuō)三種分類(lèi)的不同之處。

直接化學(xué)發(fā)光免疫分析

直接化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）是用化學(xué)發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類(lèi)化合物——acridinium ester (A E) , 是有效的發(fā)光標記物。其通過(guò)起動(dòng)發(fā)光試劑（NaOH?、H?O?）作用而發(fā)光，強烈的直接發(fā)光在一秒鐘內完成，為快速的閃爍發(fā)光。

吖啶酯作為標記物用于免疫分析，其化學(xué)反應簡(jiǎn)單、快速、無(wú)須催化劑；檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結合少，本底低；與大分子的結合不會(huì )減小所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。

CLIA開(kāi)發(fā)主要包括以下幾個(gè)步驟：

磁珠包被抗體

( 以下步驟需依據項目不同進(jìn)行工藝優(yōu)化 )

BeaverBeads®Streptavidin鏈酶親和素磁珠

利用鏈酶親和素和生物素的高特異性結合能力，BeaverBeadsRStreptavidin可與biotin標記的高純度抗體/多肽分子或核酸分子特異性結合，并具有級聯(lián)放大的作用，是一種通用的具有標記和捕獲性能的固相介質(zhì)原料。

根據粒徑的不同，產(chǎn)品可用免疫檢測、探針捕獲、細胞分選等領(lǐng)域，尤其適用于化學(xué)發(fā)光免疫診斷。相關(guān)海貍產(chǎn)品如下：

BeaverBeads®NHS生物配體快速偶聯(lián)磁珠

表面為NHS基團修飾的磁珠，能夠與帶有伯胺基團的蛋白和其他分子形成穩定的肽鍵，用于親和純化或者分析檢測抗體、抗原和其他生物分子。

與傳統的羧基、氨基磁珠相比，無(wú)需事先采用EDC/NHS或戊二醛進(jìn)行活化，只需簡(jiǎn)單講含伯氨基的生物配體溶解于偶聯(lián)緩沖液中，室溫下將蛋白溶液與NHS磁珠混合即可將生物配體共價(jià)偶聯(lián)到磁珠上，偶聯(lián)效率可達90%以上；偶聯(lián)體系pH為5-9. 相關(guān)海貍產(chǎn)品如下：

BeaverBeads®Polymer聚合物磁珠

具有快速磁響應性超順磁性、良好的分散性、粒徑均一、極低的非特異性吸附和豐富的結合位點(diǎn)等特點(diǎn)。在特定試劑（如EDC/NHS）作用下，將多種生物配體（蛋白、多肽、寡聚核苷酸、藥物分子等）共價(jià)偶聯(lián)到磁珠表面。常用于檢測、捕獲等試驗。相關(guān)海貍產(chǎn)品如下：

Beaver Magnetic Seprator stand磁性分離器

為快速分離磁珠的手工操作或高通量的自動(dòng)化操作而設計的一系列不同規格的專(zhuān)用磁性分離工具，適用于抗體純化、免疫沉淀、免疫共沉淀、細胞分選、核酸分離等相關(guān)實(shí)驗。相關(guān)海貍產(chǎn)品如下：

吖啶酯標記抗體

①將0.5mg抗體用標記緩沖液（0.1M pH7.4 PB）預處理；

②將0.1mg的吖啶鹽加入到預處理的抗體中，放置于恒溫搖床中避光孵育過(guò)夜；

③標記完成后，將結合物純化，加入BSA等蛋白保護劑，4℃避光保存。

吖啶酯是一類(lèi)可用作化學(xué)發(fā)光標記物的化學(xué)物質(zhì)，吖啶酯或吖啶磺酰胺類(lèi)化合物在有H?O?的稀堿性溶液中即能發(fā)光，不需要催化劑，發(fā)光系統簡(jiǎn)單。

同時(shí)這類(lèi)化合物的發(fā)光為閃光型，加入發(fā)光啟動(dòng)試劑后0.4s左右發(fā)射光強度即達到最大，半衰期為0.9s左右，非常省時(shí)。

基于上述特點(diǎn)，為增強吖啶酯或吖啶磺酰胺類(lèi)化合物的化學(xué)發(fā)光強度，有些在發(fā)光啟動(dòng)試劑中加入triton x-100、tween-20等表面活性劑。相關(guān)產(chǎn)品如下：

上機檢測實(shí)驗

①將磁珠包被物和吖啶酯標記物分別稀釋至工作濃度，配成試劑；

②設置全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，裝載試劑，標準品質(zhì)控品樣本分別上機，選擇對應的項目，直接進(jìn)行檢測；

③檢測剩余時(shí)間及檢測結果會(huì )顯示在屏幕上，可通過(guò)“查詢(xún)”查看歷史數據，點(diǎn)擊“導出”可將數據保存為Excel格式文件。

間接化學(xué)發(fā)光免疫分析

間接化學(xué)發(fā)光免疫分析又稱(chēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析，以酶標記生物活性物質(zhì)進(jìn)行免疫反應，免疫復合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進(jìn)行發(fā)光測試。常用的標記為HRP和AP，它們的底物分別為魯米諾和AMPPD。

具體工藝流程：

包被抗體的磁性微粒

加入樣本、標準品

清洗

加入酶標抗體/生物素化抗體

洗板

加入鏈酶親和素HRP

清洗

加入底物液

測試發(fā)光信號（如是板式發(fā)光可參考Elisa操作方式）

化學(xué)發(fā)光 (ECL)底物相關(guān)產(chǎn)品：

電化學(xué)發(fā)光免疫分析

電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是電化學(xué)發(fā)光和免疫測定相結合的產(chǎn)物，是標記免疫測定技術(shù)之一。

在電極表面有電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應，用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕 [Ru(bpy) 3 ] 2+ 標記 Ab，通過(guò) Ag-Ab 反應和磁珠分離技術(shù)，根據三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的 Ag或 Ab 進(jìn)行定量 / 定性。

ELIA 具有高度敏感，可達 Pg/ml 或 pmol ；特異性強，可重復性好，CV<5%；測定范圍寬；試劑穩定，無(wú)毒害，無(wú)污染，有效期長(cháng)。操作簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化。

三聯(lián)吡啶釕：

三丙胺（TPA）：

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