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如何大規模培養動(dòng)物細胞（上）
更新時(shí)間：2021-09-18 瀏覽次數：2688
近年來(lái)，我國的生物技術(shù)飛速發(fā)展，細胞培養已經(jīng)形成規?；?，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，大規模細胞培養可分為分批式、流加式、半連續式、連續式和灌注式、細胞工廠(chǎng)5種技術(shù)形式。
分批式培養是細胞規模培養發(fā)展進(jìn)程中較早采用的方式，也是其他操作方式的基礎。該方式采用機械攪拌式生物反應器，將細胞擴大培養后，一次性轉入生物反應器內進(jìn)行培養。在培養過(guò)程中其體積不變，不添加其他成分，待細胞增長(cháng)和產(chǎn)物形成積累到適當的時(shí)間，一次性收獲細胞、產(chǎn)物和培養基的操作方式。分批式培養操作簡(jiǎn)單，培養周期短，染菌和細胞突變的風(fēng)險小。反應器系統屬于封閉式，培養過(guò)程中與外部環(huán)境沒(méi)有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進(jìn)行其他任何控制。因培養期間細胞生長(cháng)代謝是在一個(gè)相對固定的營(yíng)養環(huán)境，不添加任何營(yíng)養成分，直觀(guān)反映細胞生長(cháng)代謝的過(guò)程，是動(dòng)物細胞工藝基礎條件或小試研究常用的手段。由于培養過(guò)程工藝簡(jiǎn)單，對設備和控制的要求較低，設備的通用性強，反應器參數的放大原理和過(guò)程控制，比較其他培養系統較易理解和掌握，在工業(yè)化生產(chǎn)中分批式培養操作是傳統的、常用的方法，其工業(yè)反應器規?？蛇_12000L。延滯期、對數生長(cháng)期、減速期、平穩期和衰退期。
分批培養的周期時(shí)間多在3-5d，細胞生長(cháng)動(dòng)力學(xué)表現為細胞先經(jīng)歷對數生長(cháng)期（48-72h)細胞密度達到最高值后，由于營(yíng)養物質(zhì)耗竭或代謝毒副產(chǎn)物的累積，細胞生長(cháng)進(jìn)入衰退期進(jìn)而死亡，表現出典型的生長(cháng)周期。
收獲產(chǎn)物通常是在細胞快要死亡前或已經(jīng)死亡后進(jìn)行。
流加式培養是在分批式培養的基礎上，采用機械攪拌式生物反應器系統，懸浮培養細胞或以懸浮微載體培養貼壁細胞。細胞初始接種的培養基體積一般為終體積的1/2-1/3，在培養過(guò)程中根據細胞對營(yíng)養物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營(yíng)養物或培養基，從而使細胞持續生長(cháng)至較高的密度，目標產(chǎn)品達到較高的水平。整個(gè)培養過(guò)程沒(méi)有流出或回收，通常在細胞進(jìn)入衰亡期或衰亡期后進(jìn)行終止，回收整個(gè)反應體系，分離細胞和細胞碎片，濃縮、純化目標蛋白。流加培養根據細胞生長(cháng)速率、營(yíng)養物消耗和代謝產(chǎn)物抑制情況，濃縮的營(yíng)養培養基的流加速率與消耗的速率相同，按底物濃度控制相應的流加過(guò)程，保證合理的培養環(huán)境與較低的代謝產(chǎn)物抑制水平。培養過(guò)程以低稀釋率流加，細胞在培養系統中停留時(shí)間較長(cháng)，總細胞密度較高，產(chǎn)物濃度較高。流加培養過(guò)程須掌握細胞生長(cháng)動(dòng)力學(xué)，能量代謝動(dòng)力學(xué)，研究細胞環(huán)境變化時(shí)的瞬間行為。流加培養細胞培養基的設計和培養條件與環(huán)境優(yōu)化，是整個(gè)培養工藝中的主要內容。在工業(yè)化生產(chǎn)，懸浮流加培養工藝參數的放大原理和過(guò)程控制，比較其他培養系統較易理解和掌握，可采用工藝參數的直接放大。流加培養是當前動(dòng)物細胞培養中占有主流優(yōu)勢的培養工藝，也是近年來(lái)動(dòng)物細胞大規模培養研究的熱點(diǎn)。流加培養中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎培養基和流加濃縮的營(yíng)養培養基。通常進(jìn)行流加的時(shí)間多在指數生長(cháng)后期，細胞在進(jìn)入衰退期之前，添加高濃度的營(yíng)養物質(zhì)?？梢蕴砑?次，也可添加多次，直至細胞密度不再提高。? 葡萄糖
葡萄糖是細胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，然而當其濃度較高時(shí)會(huì )產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細胞生長(cháng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。
?谷氨酰胺
谷氨酰胺是細胞的供能物質(zhì)和主要的氮源物質(zhì)，然而當其濃度較高時(shí)會(huì )產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細胞生長(cháng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳；
大規模培養中細胞凋亡主要由于營(yíng)養物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見(jiàn)的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。
另外，動(dòng)物細胞在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養基中進(jìn)行培養時(shí)，細胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。
?氨基酸、維生素及其他
主要包括營(yíng)養必需氨基酸、營(yíng)養非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營(yíng)養成分如膽堿、生長(cháng)刺激因子。
添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在進(jìn)行添加時(shí)，不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進(jìn)行脈沖式添加；
其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動(dòng)泵進(jìn)行緩慢連續流加。
半連續式培養又稱(chēng)為重復分批式培養或換液培養。采用機械攪拌式生物反應器系統，懸浮培養形式。在細胞增長(cháng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養物，再用新的培養液補足到原有體積，使反應器內的總體積不變。這種類(lèi)型的操作是將細胞接種一定體積的培養基，讓其生長(cháng)至一定的密度，在細胞生長(cháng)至最大密度之前，用新鮮的培養基稀釋培養物，每次稀釋反應器培養體積的1/2-3/4，以維持細胞的指數生長(cháng)狀態(tài)，隨著(zhù)稀釋率的增加培養體積逐步增加。或者在細胞增長(cháng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每隔一定時(shí)間，定期取出部分培養物，或是條件培養基，或是連同細胞、載體一起取出，然后補加細胞或載體，或是新鮮的培養基繼續進(jìn)行培養的一種操作模式。
剩余的培養物可作為種子，繼續培養，從而可維持反復培養，而無(wú)需反應器的清洗、消毒等一系列復雜的操作。在半連續式操作中由于細胞適應了生物反應器的培養環(huán)境和相當高的接種量，經(jīng)過(guò)幾次的稀釋、換液培養過(guò)程，細胞密度常常會(huì )提高。半連續式特點(diǎn)是：培養物的體積逐步增加，可進(jìn)行多次收獲，細胞可持續指數生長(cháng)，并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平，培養過(guò)程可延續到很長(cháng)時(shí)間。該操作方式的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率高，可長(cháng)時(shí)期進(jìn)行生產(chǎn)，反復收獲產(chǎn)品，可使細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動(dòng)物細胞培養和藥品生產(chǎn)中被廣泛應用。BioCore QF Pro不銹鋼微生物發(fā)酵系統
